معرفی و مکانیسم عملکرد
آنزیم (Taq DNA Polymerase) نوترکیب سیناکلون از باکتری گرمادوست تروموفیل (Thermus aquaticus BM) نشأت گرفته است؛ سویه‌ای که به‌طور طبیعی فاقد اندونوکلئاز برشی محدودکننده است. ژن این آنزیم درون باکتری میزبان (E. coli) کلون شده و مراحل خالص‌سازی آن تضمین‌کننده حذف کامل آنزیم‌های نوکلئاز غیراختصاصی است.
این آنزیم شامل یک زنجیره پلی‌پپتیدی منفرد با وزن مولکولی تقریبی ۹۵ کیلودالتون (95kDa) است که فعالیت سنتز و پلیمریزاسیون را در جهت ‘5 به ‘3 با فرآیندپذیری بالا انجام می‌دهد و فاقد فعالیت ویرایش ‘3 به ‘5 اگزونوکلئازی است. بالاترین راندمان کاتالیزوری این آنزیم در دمای ۷۵ درجه سانتی‌گراد و پی‌اچ حدود ۹ رخ می‌دهد. پایداری ساختاری در دمای بالا (95 °C)، آنزیم را برای چرخه‌های مکرر واسرشت‌سازی در واکنش‌های (PCR) کاملاً پایدار نگه می‌دارد.
این آنزیم سوبستراهای نوکلئوتیدی اصلاح‌شده را نیز می‌پذیرد؛ در نتیجه گزینه‌ای ایده‌آل برای نشانه‌گذاری قطعات (DNA) با رادیونوکلئیدها، بیوتین و دیگوکسی‌ژنین (Digoxigenin) محسوب می‌شود. همچنین به دلیل فرآیندپذیری بالا و دمای بهینه کارکرد، در تعیین توالی اسیدهای نوکلئیک (Sequencing) عملکرد چشمگیری در عبور از ساختارهای ثانویه دارد.
ویژگی‌ها و مزایای برجسته
- پایداری حرارتی اثبات‌شده: حفظ کامل عملکرد کاتالیزوری حتی پس از ۳۰ دقیقه انکوباسیون در دمای 95 °C.
- کنترل کیفی دقیق (QC):
- فاقد فعالیت اندونوکلئازی (عدم تخریب لاندا DNA پس از ۱۶ ساعت در 65 °C).
- فاقد فعالیت برش تک‌رشته (Nicking) روی پلاسمید سوپرکویل pBR 322 پس از ۴ ساعت در 65 °C.
- فاقد سنتز غیراختصاصی در غیاب پرایمر (Absence of Priming Activity).
- آزمون عملکردی موفق (Functional Assay): تاییدشده در واکنش‌های مالتی‌پلکس روی قطعات 788 bp و 977 bp ژنوم انسانی، ویروس‌های دی‌ان‌ای و سنتز cDNA از ویروس‌های آر‌ان‌ای.
کاربردهای آزمایشگاهی
- واکنش‌های عمومی و تشخیصی (Routine PCR)
- واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR)
- کلونینگ و الحاق به وکتورهای دارای پایانه تی (TA Cloning)
- تعیین توالی زنجیره پلی‌نوکلئوتیدی (DNA Sequencing)
- نشانه‌گذاری اسیدهای نوکلئیک (DNA Labeling) با ترکیبات رادیواکتیو، بیوتین یا دیگوکسی‌ژنین
شرایط نگهداری و انبارداری
- دمای نگهداری بهینه: منفی ۲۰ درجه سانتی‌گراد (-20 °C)
- روش ارسال: روی یخ خشک (Dry Ice) یا بسته‌های یخ مرطوب (Wet Ice)
- بافر نگهداری آنزیم: فرموله‌شده در بافر حاوی (Tris-HCl 20mM) با پی‌اچ ۷.۹، اتیلن‌دی‌آمین‌تتراستیک اسید (EDTA 0.1mM)، مرکاپتواتانول (2ME 5mM)، پایدارکننده‌های پروتئینی و گلیسرول ۵۰ درصد.
- توجه: برای حفظ پایداری ساختار آنزیم، از تکرار چرخه‌های انجماد و ذوب (Freeze-Thaw) خودداری شود و نمونه در فریزرهای بدون برفک (No-Frost) نگهداری نگردد.
محتویات کیت
- ویال آنزیم: با غلظت 5U/µL در بسته‌بندی‌های ۱۰۰، ۵۰۰، ۲۵۰۰ یا ۵۰۰۰ یونیتی
- محلول بافر (10X PCR Buffer):
- حاوی 500 mM KCl و Tris-HCl با پی‌اچ ۸.۴
- محلول منیزیم کلراید: لوله مجزای 50 mM MgCl2 جهت تنظیم بهینه غلظت یون منیزیم متناسب با نوع واکنش
بخش ۵: جدول مشخصات فنی (Plain Table)
| مشخصه | مقدار / توضیح |
|---|---|
| نام علمی و تجاری | SinaClon Taq DNA Polymerase (Recombinant) |
| شماره کاتالوگ Taq معمولی | DP1601 (100 units) – DP1602 (500 units) – DP1603 (2500 units) – DP1604 (5000 units) |
| فرم محصول | محلول در گلیسرول ۵۰ درصد |
| غلظت آنزیم | 5U/µL |
| وزن مولکولی | تقریباً 95kDa |
| سویه تولیدکننده | Thermus aquaticus BM کلون‌شده در E. coli |
| فعالیت پلیمرازی | جهت ‘5 به ‘3 (فاقد فعالیت تصحیح ‘3 به ‘5) |
| دمای بهینه فعالیت | 75 °C |
| تعریف واحد (Unit) | الحاق 10nmol نوکلئوتید نامحلول در اسید طی ۳۰ دقیقه در دمای 74 °C |
| دمای نگهداری | دمای -20 °C |
| شرایط ارسال | ارسال به صورت منجمد روی یخ مرطوب یا یخ خشک |
بخش ۶: راهنمای استفاده
مراحل آماده‌سازی واکنش PCR (حجم نهایی ۱۰۰ میکرولیتر):
۱. پیش از باز کردن درب ویال‌ها، کلیه محلول‌ها و آنزیم را به آرامی اسپین یا سانتریفیوژ کوتاه کنید.
۲. یک میکروتیوب استریل ۰.۵ میلی‌لیتری را روی یخ قرار دهید.
۳. اجزای واکنش را طبق جدول زیر به درون تیوب اضافه فرمایید:
| جزء واکنش | حجم | غلظت نهایی |
|---|---|---|
| بافر پی‌سی‌آر (10X PCR Buffer یا AMS) | 10µL | 1X |
| مخلوط نوکلئوتیدها (dNTP mix 10 mM) | 2µL | 0.2mM از هر نوکلئوتید |
| منیزیم کلراید (MgCl2 50 mM) | 3µL | 1.5mM |
| پرایمرها (هر کدام با غلظت 10 µM) | 5µL | 0.5µM از هر پرایمر |
| دی‌ان‌ای الگو (Template DNA) | متناسب با الگو (تا حداکثر 1 µg) | – |
| آنزیم تک پلیمراز (Taq DNA Polymerase) | 0.5µL | 2.5U به ازای ۱۰۰ میکرولیتر |
| آب مقطر استریل اتوکلاوشده | تا رساندن به حجم نهایی 100µL | – |
۴. محتویات را به‌آرامی مخلوط کرده و با یک سانتریفیوژ سریع به کف تیوب منتقل کنید.
۵. تیوب را در دستگاه ترموسایکلر قرار داده و برنامه چرخه‌ای زیر را (در ۲۵ الی ۳۵ چرخه) تنظیم کنید:
- واسرشت‌سازی (Denaturation): دمای 93 °C به مدت ۴۵ ثانیه
- اتصال پرایمر (Annealing): دمای 55 °C به مدت ۳۰ ثانیه (وابسته به Tm پرایمرها)
- طویل‌سازی (Extension): دمای 72 °C به مدت ۹۰ ثانیه
(توجه: شرایط بهینه واکنش بسته به غلظت الگو، طول قطعه و ویژگی‌های پرایمر توسط کاربر قابل تنظیم است.)
بخش ۷: بخش سوالات متداول (FAQ)
سوال ۱:
چرا آنزیم تک پلیمراز سیناکلون در دمای منفی ۲۰ درجه منجمد نمی‌شود؟
پاسخ: بافر نگهدارنده این آنزیم حاوی ۵۰ درصد گلیسرول است که به عنوان ضدیخ عمل کرده و آنزیم را به شکل مایع نگه می‌دارد. این ویژگی ساختار و فعالیت کاتالیزوری آنزیم را حفظ کرده و مانع از آسیب ناشی از تشکیل کریستال‌های یخ می‌شود.
سوال ۲: دلیل ارائه جداگانه محلول منیزیم کلراید (MgCl2) چیست؟
پاسخ: غلظت یون منیزیم در واکنش پی‌سی‌آر بر ویژگی اتصال پرایمر و فعالیت آنزیم اثر مستقیم دارد. جداسازی محلول منیزیم ۵۰ میلی‌مولار به محقق اجازه می‌دهد تا غلظت نهایی یون منیزیم را بسته به نوع توالی، پرایمر و غلظت dNTP بهینه‌سازی کند.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.